大眼鳜(Siniperca kneri)隶属于硬骨鱼纲，鲈形目，鮨科，鳜亚科，鳜属，俗称桂花鱼、白桂等，分布于中国长江及其以南水系，为中国南方特有种，是一种名贵的经济鱼类。近年来由于截流筑坝、过度捕捞、环境污染，使鳜类资源锐减，有的种类已很难采集得到。

第一内转录间隔区是核糖体基因的非编码区，具有变异快、信息量大、多态性丰富等特点(Reed et al., 2000)，可用于生物遗传进化、遗传多样性等方面的研究。目前为止，通过线粒体DNA基因对鳜类群体的遗传结构、遗传多样性和系统演化关系已经进行了一些研究，但运用ITS-1核苷酸序列对鳜类群体的研究还未见报道。本研究对3个大眼鳜群体ITS-1序列进行分析，探讨其遗传变异和多样性，为其遗传保护，开发及利用提供理论依据。

1结果与分析

1.1大眼鳜3个群体ITS-1片段扩增及序列差异

用DYGF/DYGR引物对151尾大眼鳜DNA样品进行PCR扩增, 所有样品均扩增出约864 bp左右条带(图1)。

图1大眼3个鳜群体ITS-1序列PCR扩增 Figure 1 The PCR amplification products of ITS-1 in three S. knerii populations

经拼接、去除两侧18S及5.8S rDNA的序列、校对和比对后，获得151条长度在741~758 bp之间的序列，ITS-1序列存在长度差异，可分为741 bp、753 bp、755 bp、756 bp、757 bp、758 bp六种序列(表1)。3个大眼鳜群体中，铜仁大眼鳜群体和沿河大眼鳜群体的序列长度主要为755 bp，关岭大眼鳜群体主要为753 bp。3个大眼鳜群体各碱基含量相差不大，碱基C含量最高为39.5%，G+C含量(72.8%)明显高于A+T (27.3%)。

表1大眼鳜3个群体ITS-1序列碱基含量 注: JTD: 锦江铜仁段大眼鳜群体; WYD: 乌江沿河段大眼鳜群体; BGD: 北盘江关岭段大眼鳜群体; 下同 Table 1 Nucleotide compositions of ITS-1 sequence in three populations of S. kneri Note: JTD: S. knerii in Tongren section of Jingjiang River; WYH: S. knerii in Yanhe section of Wujiang River; BGD: S. knerii in Guanling section of Bei panjiang river; The same as follows

MEGA 5.0软件分析显示：在3个大眼鳜群体中，铜仁大眼鳜群体存在1个多态位点，有GC片段的缺失；沿河大眼鳜群体被检测到6个多态位点(2个转换位点和4个颠换位点)，存在片段CTCC和TCG的插入；关岭大眼鳜群体存在2个多态位点(一个转换位点和一个颠换位点)，检测到有片段TCTC、TCC的插入和片段CGCG、CCGTCGCC的缺失。151尾大眼鳜共存在6个多态位点(表2)，包含2个转换位点和4个颠换位点。不计插入/缺失，3个大眼鳜群体共产生6种单倍型，并提交至GenBank，登录号为：KU746898-KU746903。Hap1为3个群体共享，Hap2为沿河大眼鳜群体和关岭大眼鳜群体共享，Hap5是铜仁大眼鳜群体和关岭大眼鳜群体共享单倍型，Hap3、Hap4为沿河大眼鳜独有。

表2大眼鳜3个群体ITS-1序列变异位点及单倍型分布 Table 2 Variable sites of ITS-1 sequence in three populations of S kneri and haploid type’s distribution

通过SSRhunter1.3查找大眼鳜ITS-1片段中的微卫星(SRR)位点，结果显示：在大眼鳜的ITS-1片段中发现(GC)_(8,7,3,3)、(CT)_(3,3,3)、(CG)_(3,5)、(TCG)₃ 4种重复序列，3~8次重复的简单序列共有10处，它们出现的起始位点分别为(111, 217, 339, 461)、(151, 600)、(116, 322)、(246)。

1.2大眼鳜3个群体的遗传距离

三个大眼鳜群体内，沿河大眼鳜群体个体间的遗传距离为0.000~0.007，平均遗传距离为0.001，铜仁大眼鳜群体和关岭大眼鳜群体内的遗传距离都为0.000；三个群体间，铜仁大眼鳜群体与沿河大眼鳜群体间的遗传距离为0.000，铜仁大眼鳜群体与关岭大眼鳜群体间的遗传距离为0.002，沿河大眼鳜群体与关岭大眼鳜群体间的遗传距离为0.003；6种单倍型间的遗传距离，在0.000~0.004之间。以看结果看来，这3个大眼鳜群体内和群体间的遗传变异小。

1.3大眼鳜3个群体的遗传多样性和遗传分化

通过DNA SP5.0计算得到喀斯特山区3个群体的遗传多样性参数(表3)，结果显示：沿河大眼鳜群体的多态位点数、单倍型数最多；三个群体单倍型多样性指数相差不大，关岭大眼鳜群体的略高，铜仁大眼鳜群体略低；沿河大眼鳜群体的核苷酸多样性指数最高，铜仁大眼鳜群体最低。

表3大眼鳜3个群体的遗传多样性参数 Table 3 Genetic diversity of three S. kneri populations

大眼3个群体的的Fst和Nm (表4)，结果显示：铜仁大眼鳜群体与沿河大眼鳜群体的遗传分化指数最小，基因流最大；沿河大眼鳜群体与关岭大眼鳜群体的传分化指数最大，而基因流最小。

表4大眼3个鳜群体的遗传分化 Table 4 Genetic differentiation of three S. kneri populations

2讨论

2.1大眼鳜3个群体ITS-1序列分析

研究发现，ITS序列长度在鱼类中存在多态性，这一特点在不同种群间最为明显，甚至同一种群内也存在长度的差异。鳚亚目鱼类长度变化范围为375~562 bp，且方氏云鳚种内的长度也不一，为532~562 bp (张源真等, 2012)；亚口鱼科鱼类中，最短的序列仅为52 bp，最长有达289 bp (孙玉华等, 2006)；龚理等(2015)对褐牙鲆(♀)、夏鲆(♂)及其杂交子一代的ITS-1 序列特征进行了分析，结果显示：ITS1 序列长度在种间及个体内变异比较大，褐牙鲆为743~768 bp，夏鲆和杂交子一代序列长度分别为737~747 bp 和713~758 bp。本研究所测得的3个大眼鳜群体ITS-1序列长度变异不大，主要有753 bp和755 bp两种，最短的为741 bp，最长的为758 bp；但结合脂科中的一些种类来看，差异较大，翘嘴鳜(登录号为: AY452494)为745 bp，花鲈(Lateolabrax) (登录号: AB375634) 738 bp，石斑鱼(Epinephelus)为532~537 bp。Huyse等(2004)认为ITS-1片段具有序列长度多态性，主要是由微卫星拷贝数不同而造成。在本研究中，并不是所有的插入或缺失都位于重复区域，所以大眼鳜ITS-1序列长度差异不能完全用重复序列来解释，徐晖等(2008)在对舌鳎亚科鱼类ITS-1序列的研究中及马朋等(2012)对脊尾白虾ITS-1序列研究中都得出了相同的结论。ITS片段是不加入成熟核糖体的非编码区，受到的选择压力较小、进化速率快，这也是导致ITS-1序列存在长度差异的因素之一。

本研究中3个大眼鳜群体ITS-1的GC含量较高，达72.8%，而高GC含量被认为是一个比较原始的特征(Rodríguez-Trelles et al., 2000)，所以可以推测大眼鳜是一个比较原始的种类。微卫星是以1~6 bp的短核苷酸为基本单元，首尾顺次相接组成的串联重复序列，能对生物种质进行鉴定(柳莹等, 2014)。本研究所测的ITS-1中，发现多种重复序列，共有(GC)_n、(CT)_n、(CG)_n、(TCG)_n  4种，其中(GC)_n出现的频率最高。目前为止，对鳜亚科鱼类ITS序列的研究缺乏，本研究结果可以为鳜类种质资源的鉴定与保护累积提供可靠的理论依据。

2.2大眼鳜3个群体的遗传多样性及遗传分化

遗传多样性与自然选择产生的适应性及物种的进化潜力密切相关，遗传多样越丰富，物种对环境变化的适应能力越强(陈金平等, 2004)。本研究测定了3个大眼鳜群体的ITS-1序列，检测到6个多态位点，发现一些片段的插入或缺失。研究表明，3个群体中沿河大眼群体核苷酸多样性指数略高(0.000 62)，而铜仁群体较低(0.000 28)，这3个群体的核苷酸多样性指数远远低于4个鲤鱼群体(0.008 57) (钟立强等, 2011)及贵州地方鲫鱼群体(0.012 22) (郭健康等, 2015)，贵州3个大眼鳜群体表现出偏低的遗传多样性。从单倍型多样性水平来看，沿河大眼鳜群体拥有5个单倍型，但大多数单倍型只为少数个体独有，表现为较低水平的单倍型多样性(0.267)；3个群体的单倍型多样相差不大，均低，但从总体上看来，这3个群体的单倍型多样性为0.622，高于贵州鲫鱼群体(0.552)而略低于4个鲤鱼群体(0.637)，说明贵州大眼鳜群体遗传多样性较丰富。

遗传距离多用来分析种群的遗传分化及遗传多样性，其值的大小，反映了种群分化程度的大小(董新培等, 2014)。3个大眼鳜群体内，沿河大眼鳜群体个体间的遗传距离为0.000~0.007，平均遗传距离为0.001，其余两群体都为0.000；群体间的遗传距离为0.000~0.003，表明沿河大眼鳜群体遗传分化略大。遗传学认为，若遗传距离大于0.01，就认为该种群遗传变异大(Lan and Shi, 1993)，而3个大眼鳜群体内和群体间的遗传距离都小于0.01，遗传变异小。这与朱树人等(2015)对3种鳢属鱼类的ITS 序列的研究结果和凌去非等(2006)对丁鱥不同群体ITS-1序列的研究结果一致，表明ITS-1序列在种群内变异较小。

遗传分化指数(Fst)常用来判断群体间的遗传差异。3个大眼鳜群体间，沿河大眼鳜群体与铜仁大眼鳜群体体间分化较小(0≤Fst≤0.05)，而关岭大眼鳜群体与这两个群体间就表现出较高的分化(Fst≥0.25)。基因流(Nm)是指基因在不同群体间的转移、交流，它会把一个群体中的基因带给另一个群体，基因流越大，群体间的相似性就越大(曲若竹等, 2004)。铜仁大眼鳜群体与沿河大眼鳜群体的基因流为27.62，大于1说明这是两个群体存在基因交流，关岭大眼鳜与其他两个群体基因流均小于1，说明关岭大眼鳜群体与其他两个群体间基因交流匮乏。贵州3个大眼鳜群体间的这种关系，可能是因为铜仁大眼群体与沿河大眼鳜群体同属长江流域中的鳜类，且两者地理位置较近，生存环境类似，使两者有着这样的联系；而关岭大眼鳜群体是珠江流域北盘江中的鳜类，并且与其他两个群体相距较远，生存环境不同，使得关岭大眼鳜与其他两个群体产生这样的差异。

3材料与方法

3.1试验材料

野生大眼鳜采自3个水产种质资源保护区，共计151尾。其中乌江黄颡鱼国家级水产种质资源保护区沿河县城河段35尾、锦江河特有鱼类国家级水产种质资源保护区铜仁段26尾和北盘江九盘段特有鱼类省级水产种质资源保护区关岭段90尾。取活鱼样本背部肌肉浸泡于无水乙醇中，并保存于-20℃的冰箱中备用。利用DNA提取试剂盒(北京天根)提取基因组DNA，用1.5%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计(Thermo NanoDrop2000C)检测其完整性与吸光值。

3.2引物设计与PCR扩增

参照翘嘴鳜(S. chuatsi) (登录号: AY452494) ITS-1序列设计引物，DYGF：5’-CGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3’；DYGR：5’-GCAATTCACATTAGTTCTCGC-3’，引物送往北京诺赛基因进行合成。

PCR反应体系为20 µL：其中DNA模板2 µL，2×GC rich PCR Master Mix (北京天根) 10 µL，上、下游引物各1 µL，利用灭菌水补齐至20 µL。PCR扩增条件：95℃预变性5 min；95℃变性45 s，61.4℃退火30 s，72℃延伸50 s，34个循坏；最后再2072℃延伸5 min，4℃保存。

3.3 PCR产物的测定

运用1.2%琼脂糖凝胶电泳将PCR产物切胶回收纯化，PCR产物的测定由北京诺赛基因完成。

3.4数据的处理

利用Seqman做正反向链的拼接，手动校正并去掉两端引物及部分序列；碱基组成和变异位点的统计及遗传距离的计算由Mega 5.0完成；运用DNASP 5.0计算单倍型多样度、核苷酸多样度、以及群体间遗传分化指数(Fst)，基因流由Nm≈(1-Fst)/(2Fst)计算，利用SSRHunter1.3查找简单重复序列。

作者贡献

郭健康是本研究的执行者，负责样品采集、实验设计、数据处理与分析、论文撰写等；安苗是本研究指导教师、通讯作者，负责试验指导及论文修改；曹恒源负责采样和论文的纠错；李珊和陈薛伟杰负责PCR扩增及送样测序。

致谢

本研究由安苗副教授资助。

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